Sample records for RODOPSINA (rhodopsin)
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Aproximaciones de bioquímica clásica al estudio de la relación entre la estructura y la función de la rodopsina

Medina, Rafael; Moller, Carolina; Perdomo, Deisy; Bubis, José
2008-06-01

Resumen en español La proteína fotorreceptora rodopsina (R) fue extraída de los segmentos externos de los bastoncillos de retinas bovinas con el detergente n-dodecil β-D-maltósido (DM) y purificada a homogeneidad mediante cromatografía de afinidad. El entrecruzamiento químico de la R y de la rodopsina fotoactivada (R*) con los agentes bifuncionales sulfo-succinimidilo 4-(Nmaleimidometilo) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) o m-maleimidobenzoilo-N-hidroxisuccinimido ester, sugi (mas) rieron la naturaleza oligomérica de la proteína fotorreceptora. La caracterización de los parámetros hidrodinámicos de la R y la R* en presencia de 0.1% DM, mediante cromatografía de exclusión molecular y sedimentación sobre gradientes de sacarosa, permitió estimar los tamaños de los complejos R:DM y R*: DM. Los resultados concuerdan con una estructura cuaternaria dimérica tanto para la R como para la R*. La R entrecruzada con sulfo-SMCC, en presencia de luz, fue estabilizada en un fotointermediario que absorbió a ~ 470 nm. Experimentos de proteólisis con termolísina sobre los dímeros nativos de R y sobre los monómeros de R generados por medio del uso de altas concentraciones de DM, complementados con estudios de modelaje basados en la estructura cristalina reportada de la proteína, sugirieron que el reactivo sulfo-SMCC generó un entrecruzamiento intramolecular entre la Cys140 y la Lys248 de la R, el cual posiblemente es el responsable de la incapacidad de la proteína de sufrir el cambio conformacional requerido para llegar a su estado fotoactivado. Resumen en inglés The photoreceptor protein rhodopsin (R) was extracted from bovine retinal rod outer segments using the detergent n-dodecyl β-D-maltoside (DM), and purified to homogeneity by affinity chromatography. Chemical cross-linking of R and photoactivated rhodopsin (R*) with the bifunctional agents sulfo-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ciclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) or m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, suggested the oligomeric nature of this photorecept (mas) or protein. The characterization of the hydrodynamic parameters of R and R* in the presence of 0.1% DM, using molecular exclusion chromatography and sedimentation on sucrose gradients, allowed us to estimate the size of the R:DM and R*:DM complexes. Our results agreed with a dimeric quaternary structure for both, R and R*. R crosslinked with sulfo-SMCC, in the presence of light, was stabilized in a photointermediate that absorbed at ~ 470 nm. Experiments of proteolysis with termolysine on R native dimers and R monomers generated by using high concentrations of DM, together with modeling studies based on the reported crystal structure of the protein, suggested that sulfo-SMCC generated an intramolecular cross-link between Cys140 and Lys248 of R, which was probably responsible for the incapacity of the protein to display the conformational change required to reach its photoactivated state.

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